Pagbasa ng Nuclear at Chloroplast DNA mula sa Iisang Sequencing Reads

Sa Ms. Eranga Pawani Witharana bilang unang may-akda, isang pangkat ng pananaliksik na nakasentro sa aming laboratoryo ay nagpakita ng isang paraan para sa mahusay na pagbawi ng nuclear phylogenetic na impormasyon mula sa parehong pagkakasunud-sunod na mga pagbasa na ginamit para sa pagsusuri ng chloroplast genome, na nagpapagana ng pinagsamang paghahambing ng parehong data source.

Ang mga genome ng Chloroplast (cp) ay malawakang ginagamit sa mga phylogenetics ng halaman dahil ang mga ito ay medyo maliit at madaling masubaybayan. Sa maraming angiosperms, gayunpaman, ang cpDNA ay minana nang uniparentally—kadalasang maternal—at samakatuwid ay maaaring magdala ng ibang phylogenetic signal mula sa biparentally inherited nuclear DNA. Ang data ng chloroplast lamang ay maaaring hindi sapat upang malutas ang ilang mga relasyon sa ebolusyon.

Upang makakuha ng mas komprehensibong phylogenetic na impormasyon, ang nuclear DNA na impormasyon, na minana mula sa parehong mga magulang, ay mahalaga din. Ang Nuclear DNA ay nagbibigay ng mas holistic na genetic perspective kaysa sa cpDNA. Gayunpaman, ang pagkuha ng buong nuclear DNA na impormasyon ay dating nauugnay sa mataas na gastos. Sa mga nakalipas na taon, lumitaw ang mga napaka-epektibong pamamaraan para sa pagkuha ng nuclear DNA data (hal., target capture, RNA sequencing), ngunit sa pangkalahatan ay kinakailangan na maghanda ng chloroplast at nuclear DNA na data nang hiwalay.

Sa pag-aaral na ito, upang matugunan ang hamon na ito, nakatuon kami sa pagbuo at pagpapatunay ng isang bagong pamamaraan na kumukuha ng nuclear DNA phylogenetic na impormasyon mula sa "eksaktong pareho" na raw (hindi naproseso) na read sequence data na ginamit para sa pagsusuri ng chloroplast genome.

Gumamit kami ng bagong computational tool na tinatawag na Read2Tree. Binibigyang-daan ng Read2Tree ang direkta at mahusay na pagkuha ng conserved nuclear gene sequences mula sa raw read sequence data.

Matapos mailathala ang papel, inilabas namin sa GitHub repository “Eranga-Witharana/rt2-phylogenomics” ang analysis pipeline upang mapadali ang reproduksiyon at karagdagang paggamit ng workflow.

Pangunahing Tampok at Mga Bentahe ng Read2Tree

• Cost-effective: Ang paggamit ng parehong raw data bilang chloroplast analysis ay nakakabawas sa mga gastos sa pagkuha ng data.
• Comprehensive nuclear data retrieval: Ang isang reference na genome-guided approach ay nagbibigay-daan sa pagkuha ng isang malaking bilang ng mga conserved nuclear genes.
• Naka-streamline na pagsusuri: Gumagana bilang isang pinagsama-samang pipeline mula sa pagkakakilanlan ng gene hanggang sa pagbuo ng pagkakahanay hanggang sa pagbuo ng phylogenetic tree.
• Walang kinakailangang pasadyang paghahanda: Gumagamit ng mga umiiral nang reference na dataset, na inaalis ang pangangailangang magdisenyo at mag-validate ng mga set o database ng probe na partikular sa species.
• Kapaki-pakinabang para sa pagsusuri ng discordance: Naglalabas ng mga indibidwal na data ng alignment ng gene, na maaaring magamit upang siyasatin ang mga sanhi ng phylogenetic discordance (tulad ng mga pagkakaiba sa pagitan ng mga gene tree at species tree).

Pamamaraan ng Pagpapatunay: Isang Halimbawa ng Paggamit ng Aurantioideae Plants

Upang mapatunayan ang pagiging epektibo at pagiging kapaki-pakinabang ng bagong pamamaraang ito (nuclear DNA phylogenetic analysis gamit ang Read2Tree), na-target namin ang pangkat ng halaman na Aurantioideae. Ang Aurantioideae, na kinabibilangan ng citrus at mga malalapit na kamag-anak nito, ay isang mahalagang pangkat na may mga kumplikadong ugnayang phylogenetic.

Gamit ang Read2Tree, nakuha ng pag-aaral ang mga conserved nuclear gene sequence para sa 39 Aurantioideae species at inihambing ang mga nagresultang nuclear phylogenies sa mga chloroplast genome tree na binuo mula sa parehong raw reads.

• Paghahambing sa mga umiiral nang nuclear DNA na pamamaraan: Ang nuclear DNA phylogenetic puno na nakuha ng Read2Tree ay inihambing sa ang puno na nabuo ng RAD-Seq, isa pang nuclear DNA na pamamaraan na ginamit sa mga nakaraang pag-aaral. Ang paghahambing na ito sinuri ang pagiging maaasahan ng Read2Tree.
• Pagsasama sa chloroplast phylogenetic analysis: Ang mga phylogenetic tree ng chloroplast genome ay ginawa mula sa parehong raw data at inihambing sa nuclear DNA tree na ginawa ng Read2Tree. Sinisiyasat ng diskarteng ito ang cytonuclear discordance, ang hindi pagkakatugma sa pagitan ng chloroplast at nuclear phylogenies.
• Pagsusuri ng mga sanhi ng pagkakaiba: Paggamit ng indibidwal na gene alignment data output sa pamamagitan ng Read2Tree at pinagsama ito sa iba pang mga pamamaraan (D-statistic, DFOIL, QuiBL, atbp.), sinuri namin kung ang naobserbahang phylogenetic discordance ay sanhi ng mga kumplikadong proseso ng ebolusyon gaya ng hindi kumpletong pag-uuri ng lineage (ILS), introgression, o sinaunang introgression.

(Pagiging Epektibo ng Paraan)

Ang mga resulta ng pag-aaral na ito ay nagsiwalat ng mga sumusunod na punto, na nagpapakita ng pagiging epektibo ng pamamaraan gamit ang Read2Tree:

• Paghahambing ng nuclear phylogenies: Ang Read2Tree nuclear phylogenies ay higit na naaayon sa mga relasyon na iniulat ng isang naunang RAD-Seq na pag-aaral. Ang ilang mga placement ng taxon ay nanatiling hindi sigurado, kaya ang pagsusuri ay hindi dapat basahin bilang paglutas ng bawat sangay nang tiyak.
• Mahusay na muling paggamit ng data: Ang parehong short-read na dataset ay sumusuporta sa parehong chloroplast genome analysis at nuclear phylogenetic inference, na ginagawang mas cost-efficient ang diskarte kaysa sa paghahanda ng hiwalay na sequencing dataset. Ito ay isang kalamangan sa pagkuha ng data, hindi isang pormal na pagsusuri sa ekonomiya.
• Pagsusuri ng phylogenetic discordance: Iminungkahi ng maraming pagsusuri na ang hindi kumpletong pag-uuri ng lineage (ILS) ay nagpapaliwanag sa karamihan ng naobserbahang pagkakaiba, habang ang introgression at sinaunang introgression ay maaari ding nag-ambag sa loob ng mga partikular na clade.

Konklusyon

Ang pag-aaral ay nagpakita na ang Read2Tree ay maaaring mabawi ang mga conserved nuclear genes mula sa parehong raw reads na ginamit para sa chloroplast genome analysis, na nagbibigay-daan sa paghahambing ng nuclear at chloroplast phylogenies at pagsisiyasat ng mga kontribusyon mula sa hindi kumpletong lineage sorting (ILS) at introgression. Ang ilang mga placement ng taxon ay nanatiling hindi sigurado, at hindi nalutas ng pag-aaral ang bawat sangay nang tiyak.

Ang pamamaraang ito ay may potensyal na mag-ambag sa mas detalyado at maaasahang mga rekonstruksyon ng mga kasaysayan ng ebolusyon sa hinaharap na pananaliksik sa phylogenetic ng halaman.

Mga Potensyal na Aplikasyon sa Pananaliksik sa Mga Sangkap ng Pagkain

Ang mga sumusunod na punto ay naglalarawan ng mga potensyal na aplikasyon na hinuha mula sa napatunayang phylogenetic workflow. Hindi direktang sinubukan ng papel ang pag-aanak ng pananim, lasa, halaga ng nutrisyon, o paglaban sa sakit.

Halimbawa, ang mga pangkat tulad ng Aurantioideae na ginamit sa pag-aaral na ito ay kinabibilangan ng mga species ng halaman na mahalaga para sa pagkain at mga gamit na panggamot sa buong mundo. Ang pag-unawa sa kanilang tumpak na mga ugnayang phylogenetic at ang masalimuot na kasaysayan ng ebolusyon ng hybridization ay napakahalaga para sa pagpapabuti ng pananim sa agrikultura at para sa pag-iingat at paggamit ng mahahalagang genetic resources (tulad ng mga ligaw na kamag-anak) na maaaring maging mapagkukunan ng pagkain sa hinaharap.

Ang bagong pamamaraang ito gamit ang Read2Tree ay nagbibigay-daan sa mahusay na pagkuha ng impormasyon mula sa parehong chloroplast at nuclear DNA gamit ang parehong dataset, na nagbibigay-daan sa mas komprehensibo at detalyadong phylogenetic na pagsusuri ng maraming uri ng pananim ng pagkain na dati ay mahirap suriin.

Higit pa rito, ang kakayahang suriin ang mga kumplikadong prosesong henetiko gaya ng incomplete lineage sorting (ILS) at introgression ay nagbibigay ng batayan upang maunawaan, sa antas ng gene, kung paano nakuha at napanatili sa kasaysayan ng ebolusyon ang iba’t ibang katangian ng mga halamang pagkain—tulad ng mataas na halagang nutrisyonal, natatanging lasa, at resistensiya sa mga peste at sakit.

Sa ganitong paraan, ang pamamaraang ito ay masasabing nag-aalok ng mahalagang pundasyon para sa pagpapalalim ng ating pag-unawa sa pagkakaiba-iba ng mga halaman na ginagamit bilang pagkain at para sa pagmamaneho ng pananaliksik tungo sa pagpapaunlad ng mga pinahusay na uri at napapanatiling paggamit ng mapagkukunan.