การอ่าน DNA ในนิวเคลียสและ DNA ในคลอโรพลาสต์จากข้อมูลการหาลำดับเบสชุดเดียวกัน

โดยมี Eranga Pawani Witharana เป็นผู้เขียนคนแรก กลุ่มวิจัยที่มีห้องปฏิบัติการของเราเป็นแกนหลักได้แสดงวิธีดึงข้อมูลสายวิวัฒนาการจาก DNA ในนิวเคลียสอย่างมีประสิทธิภาพ โดยใช้ข้อมูลการหาลำดับเบสชุดเดียวกับการวิเคราะห์จีโนมคลอโรพลาสต์ ทำให้สามารถเปรียบเทียบข้อมูลทั้งสองแบบบูรณาการได้

จีโนมคลอโรพลาสต์ (chloroplast; cp) ใช้กันอย่างแพร่หลายในงานสายวิวัฒนาการของพืช เพราะมีขนาดค่อนข้างเล็กและวิเคราะห์ได้ง่าย อย่างไรก็ตาม ในพืชดอกจำนวนมาก cpDNA ถ่ายทอดจากพ่อหรือแม่เพียงฝ่ายเดียว—มักเป็นฝ่ายแม่—จึงอาจให้ phylogenetic signal ต่างจาก DNA ในนิวเคลียสที่ถ่ายทอดจากทั้งสองฝ่าย ดังนั้นข้อมูลคลอโรพลาสต์เพียงอย่างเดียวอาจไม่เพียงพอสำหรับอธิบายความสัมพันธ์เชิงวิวัฒนาการบางส่วน

เพื่อให้ได้ข้อมูลสายวิวัฒนาการที่ครอบคลุมมากขึ้น ข้อมูล DNA ของนิวเคลียร์ซึ่งสืบทอดมาจากทั้งพ่อและแม่ก็มีความสำคัญเช่นกัน DNA นิวเคลียร์ให้มุมมองทางพันธุกรรมแบบองค์รวมมากกว่า cpDNA อย่างไรก็ตาม การได้รับข้อมูล DNA นิวเคลียร์เต็มรูปแบบก่อนหน้านี้เกี่ยวข้องกับค่าใช้จ่ายสูง ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา วิธีการที่คุ้มค่าอย่างมากในการรับข้อมูล DNA นิวเคลียร์ได้เกิดขึ้น (เช่น การจับเป้าหมาย การจัดลำดับ RNA) แต่โดยทั่วไปจำเป็นต้องเตรียมข้อมูลคลอโรพลาสต์และข้อมูล DNA นิวเคลียร์แยกกัน

ในการศึกษานี้ เพื่อจัดการกับความท้าทายนี้ เรามุ่งเน้นไปที่การพัฒนาและการตรวจสอบความถูกต้องของวิธีการใหม่ที่ได้รับข้อมูลสายวิวัฒนาการดีเอ็นเอนิวเคลียร์จากข้อมูลลำดับการอ่านดิบ (ยังไม่ได้ประมวลผล) ที่ "เหมือนกันทุกประการ" ที่ใช้สำหรับการวิเคราะห์จีโนมของคลอโรพลาสต์

เราใช้เครื่องมือคำนวณชนิดใหม่ที่เรียกว่า Read2Tree. Read2Tree ช่วยให้สามารถแยกลำดับยีนนิวเคลียร์แบบอนุรักษ์ได้โดยตรงและมีประสิทธิภาพจากข้อมูลลำดับการอ่านแบบดิบ

หลังจากตีพิมพ์บทความ เราได้เผยแพร่ analysis pipeline ไว้ใน GitHub repository “Eranga-Witharana/rt2-phylogenomics” เพื่อให้ทำซ้ำและประยุกต์ใช้ workflow ต่อได้สะดวกขึ้น

ลักษณะสำคัญและข้อดีของ Read2Tree

• คุ้มต้นทุน: การใช้ข้อมูลดิบเดียวกันกับการวิเคราะห์คลอโรพลาสต์จะช่วยลดต้นทุนการได้มาซึ่งข้อมูล
• การเรียกค้นข้อมูลนิวเคลียร์ที่ครอบคลุม: วิธีการอ้างอิงจีโนมช่วยให้สามารถสกัดยีนนิวเคลียร์ที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้จำนวนมาก
• การวิเคราะห์ที่คล่องตัว: ทำหน้าที่เป็นท่อส่งแบบบูรณาการตั้งแต่การระบุยีนไปจนถึงการสร้างแนวร่วมไปจนถึงการสร้างต้นไม้สายวิวัฒนาการ
• ไม่จำเป็นต้องเตรียมการแบบกำหนดเอง: ใช้ชุดข้อมูลอ้างอิงที่มีอยู่ โดยไม่จำเป็นต้องออกแบบและตรวจสอบชุดโพรบหรือฐานข้อมูลเฉพาะสายพันธุ์
• มีประโยชน์สำหรับการวิเคราะห์ความไม่ลงรอยกัน: ส่งออกข้อมูลการจัดตำแหน่งยีนแต่ละรายการ ซึ่งสามารถใช้เพื่อตรวจสอบสาเหตุของความไม่ลงรอยกันทางสายวิวัฒนาการ (เช่น ความคลาดเคลื่อนระหว่างต้นยีนและต้นไม้สายพันธุ์)

การตรวจสอบวิธี — ตัวอย่างจากวงศ์ย่อยส้ม (Aurantioideae)

เพื่อตรวจสอบประสิทธิภาพและประโยชน์ของวิธีการใหม่นี้ (การวิเคราะห์สายวิวัฒนาการดีเอ็นเอนิวเคลียร์โดยใช้ Read2Tree) เราได้กำหนดเป้าหมายไปที่กลุ่มพืช Aurantioideae Aurantioideae ซึ่งรวมถึงส้มและญาติใกล้ชิด เป็นกลุ่มสำคัญที่มีความสัมพันธ์ทางสายวิวัฒนาการที่ซับซ้อน

งานวิจัยใช้ Read2Tree เพื่อเก็บลำดับยีนนิวเคลียร์ที่อนุรักษ์ไว้จากพืช Aurantioideae 39 ชนิด และเปรียบเทียบกับสายวิวัฒนาการของจีโนมคลอโรพลาสต์ที่สร้างจาก raw reads ชุดเดียวกัน

• การเปรียบเทียบกับวิธีวิเคราะห์ DNA ในนิวเคลียสที่มีอยู่ — นำต้นไม้สายวิวัฒนาการจาก Read2Tree ไปเปรียบเทียบกับต้นไม้ที่สร้างด้วย RAD-Seqจากงานวิจัยก่อนหน้า เพื่อประเมินความน่าเชื่อถือของ Read2Tree
• การบูรณาการกับการวิเคราะห์สายวิวัฒนาการของคลอโรพลาสต์ — สร้างต้นไม้สายวิวัฒนาการของจีโนมคลอโรพลาสต์จากข้อมูลดิบชุดเดียวกัน แล้วเปรียบเทียบกับต้นไม้ DNA ในนิวเคลียสจาก Read2Tree เพื่อศึกษาความไม่สอดคล้องระหว่างสายวิวัฒนาการของคลอโรพลาสต์กับนิวเคลียส (cytonuclear discordance)
• การวิเคราะห์สาเหตุของความไม่สอดคล้อง — นำข้อมูลการจัดเรียงลำดับของยีนแต่ละยีนจาก Read2Tree มารวมกับ D-statistic, DFOIL, QuIBL และวิธีอื่น เพื่อวิเคราะห์บทบาทของการคัดแยกสายวิวัฒนาการที่ไม่สมบูรณ์ (incomplete lineage sorting; ILS) การแทรกซึมของยีน (introgression) และการแทรกซึมของยีนในอดีต

ผลลัพธ์ — ประสิทธิผลของวิธี

ผลการศึกษาครั้งนี้เผยให้เห็นประเด็นต่อไปนี้ ซึ่งแสดงให้เห็นถึงประสิทธิผลของวิธีการโดยใช้ Read2Tree:

• การเปรียบเทียบสายวิวัฒนาการของ DNA ในนิวเคลียส—ผลจาก Read2Tree โดยรวมสอดคล้องกับความสัมพันธ์ที่รายงานในงาน RAD-Seq ก่อนหน้า แต่ตำแหน่งของ taxa บางกลุ่มยังไม่แน่นอน จึงไม่ได้หมายความว่าทุก branch ได้รับการแก้ไขอย่างเด็ดขาด
• การใช้ข้อมูลซ้ำอย่างมีประสิทธิภาพ—short-read dataset ชุดเดียวใช้ได้ทั้งการวิเคราะห์จีโนมคลอโรพลาสต์และการอนุมานสายวิวัฒนาการของ DNA ในนิวเคลียส จึง cost-efficient กว่าการเตรียม sequencing datasets แยกกัน ทั้งนี้เป็นข้อได้เปรียบด้านการได้มาซึ่งข้อมูล ไม่ใช่การประเมินทางเศรษฐศาสตร์อย่างเป็นทางการ
• การวิเคราะห์ phylogenetic discordance—การวิเคราะห์หลายวิธีชี้ว่า incomplete lineage sorting (ILS) เป็นสาเหตุหลักของความไม่สอดคล้องส่วนใหญ่ ส่วน introgression และ ancient introgression อาจมีส่วนในบาง clades

สรุปผล

งานวิจัยแสดงว่า Read2Tree สามารถดึง conserved nuclear genes จาก raw reads ชุดเดียวกับที่ใช้ใน chloroplast genome analysis เพื่อเปรียบเทียบ nuclear และ chloroplast phylogenies และตรวจบทบาทของ incomplete lineage sorting (ILS) กับ introgression ได้ ตำแหน่งของ taxa บางกลุ่มยังไม่แน่นอน จึงไม่ได้สรุปทุก branch อย่างเด็ดขาด

วิธีนี้มีศักยภาพที่จะนำไปสู่การสร้างประวัติศาสตร์วิวัฒนาการขึ้นใหม่ที่มีรายละเอียดและเชื่อถือได้มากขึ้นในการวิจัยสายวิวัฒนาการพืชในอนาคต

ศักยภาพในการประยุกต์ใช้กับงานวิจัยวัตถุดิบอาหาร

เนื้อหาต่อไปนี้เป็นเพียงการประยุกต์ใช้ที่เป็นไปได้ซึ่งอนุมานจาก phylogenetic workflow ที่ผ่านการตรวจสอบแล้ว บทความนี้ไม่ได้ทดสอบการปรับปรุงพันธุ์ รสชาติ คุณค่าทางโภชนาการ หรือความต้านทานโรคโดยตรง

ตัวอย่างเช่น กลุ่มต่างๆ เช่น Aurantioideae ที่ใช้ในการศึกษานี้รวมถึงพันธุ์พืชที่มีความสำคัญต่อการใช้อาหารและยาทั่วโลก การทำความเข้าใจความสัมพันธ์ทางสายวิวัฒนาการที่แม่นยำและประวัติวิวัฒนาการที่ซับซ้อนของการผสมพันธุ์เป็นสิ่งสำคัญสำหรับการปรับปรุงพืชผลในการเกษตรและสำหรับการอนุรักษ์และการใช้ประโยชน์จากทรัพยากรพันธุกรรมที่มีคุณค่า (เช่น ญาติป่า) ที่อาจกลายเป็นแหล่งอาหารในอนาคต

วิธีการใหม่ที่ใช้ Read2Tree ช่วยให้ดึงข้อมูลจากทั้งคลอโรพลาสต์และ DNA นิวเคลียร์ได้อย่างมีประสิทธิภาพโดยใช้ชุดข้อมูลเดียวกัน ช่วยให้วิเคราะห์สายวิวัฒนาการของพืชอาหารหลายชนิดได้อย่างครอบคลุมและละเอียดมากขึ้น ซึ่งก่อนหน้านี้ยากต่อการวิเคราะห์

นอกจากนี้ ความสามารถในการวิเคราะห์กระบวนการทางพันธุกรรมที่ซับซ้อน เช่น การคัดแยกสายวิวัฒนาการที่ไม่สมบูรณ์ (ILS) และการแทรกซึมของยีนเป็นรากฐานสำหรับการทำความเข้าใจในระดับพันธุกรรม ว่าลักษณะที่หลากหลายของพืชอาหาร เช่น คุณค่าทางโภชนาการสูง รสชาติเฉพาะ และความต้านทานต่อศัตรูพืชและโรค ได้รับการได้มาและบำรุงรักษาตลอดประวัติศาสตร์วิวัฒนาการอย่างไร

ด้วยวิธีนี้ อาจกล่าวได้ว่าวิธีการนี้เป็นรากฐานที่สำคัญในการทำความเข้าใจให้ลึกซึ้งยิ่งขึ้นเกี่ยวกับความหลากหลายของพืชที่ใช้เป็นอาหาร และเพื่อขับเคลื่อนการวิจัยไปสู่การพัฒนาพันธุ์ที่ได้รับการปรับปรุงและการใช้ทรัพยากรอย่างยั่งยืน