Leitura de DNA nuclear e cloroplastidial a partir das mesmas leituras de sequenciamento

Com a Sra. Eranga Pawani Witharana como primeira autora, um grupo de pesquisa centrado em nosso laboratório demonstrou um método para recuperar eficientemente informações filogenéticas nucleares a partir das mesmas leituras de sequenciamento usadas para a análise do genoma de cloroplastos, permitindo uma comparação integrada de ambas as fontes de dados.

Os genomas de cloroplastos (cp) são amplamente utilizados na filogenética vegetal porque são relativamente pequenos e tratáveis. Em muitas angiospermas, entretanto, cpDNA é herdado uniparentalmente — frequentemente maternamente — e pode, portanto, transmitir um sinal filogenético diferente do DNA nuclear herdado biparentalmente. Os dados de cloroplastos sozinhos podem, consequentemente, ser insuficientes para resolver algumas relações evolutivas.

Para obter informações filogenéticas mais abrangentes, a informação de DNA nuclear, que é herdada de ambos os pais, também é importante. A DNA nuclear oferece uma perspectiva genética mais holística do que cpDNA. No entanto, adquirir informações completas sobre DNA nucleares estava anteriormente associado a altos custos. Nos últimos anos, métodos altamente econômicos para obter dados de DNA nucleares surgiram (por exemplo, captura de alvos RNA sequenciamento), mas geralmente tem sido necessário preparar dados de cloroplastos e DNA nucleares separadamente.

Neste estudo, para enfrentar esse desafio, focamos no desenvolvimento e validação de um novo método que obtém informações nucleares DNA filogenéticas a partir dos "mesmos" dados brutos (não processados) de sequência lida usados para a análise do genoma de cloroplastos.

Utilizamos uma nova ferramenta computacional chamada Read2Tree. Read2Tree possibilita a extração direta e eficiente da energia nuclear conservada Sequências gênicas a partir de dados brutos de sequência de leitura.

Após a publicação do artigo, disponibilizamos publicamente o analysis pipeline no GitHub repository “Eranga-Witharana/rt2-phylogenomics”, para facilitar a reprodução e aplicações posteriores do workflow.

Principais Características e Vantagens da Read2Tree

• Custo-efetivo: Usar os mesmos dados brutos da análise por cloroplastos reduz os custos de aquisição de dados.
• Recuperação abrangente de dados nucleares: Uma abordagem guiada por genomas de referência permite a extração de um grande número de genes nucleares conservados.
• Análise simplificada: Funciona como um canal integrado desde a identificação de genes até a geração de alinhamento e a construção de árvores filogenéticas.
• Não é necessário preparar personalizado: Utiliza conjuntos de dados de referência existentes, eliminando a necessidade de projetar e validar conjuntos de sondas ou bancos de dados específicos de cada espécie.
• Útil para análise de discordância: Gera dados individuais de alinhamento gênico, que podem ser usados para investigar causas de discordância filogenética (como discrepâncias entre árvores genéticas e árvores de espécies).

Validação de Método: Um Exemplo Usando Plantas Aurantioideae

Para validar a eficácia e utilidade desse novo método (análise filogenética de DNA nuclear usando Read2Tree), focamos no grupo de plantas Aurantioideae. Aurantioideae, que inclui cítricos e seus parentes próximos, é um grupo importante com relações filogenéticas complexas.

Usando Read2Tree, o estudo recuperou sequências de genes nucleares conservados para 39 espécies de Aurantioideae e comparou as filogenias nucleares resultantes com árvores do genoma cloroplasto construídas a partir das mesmas leituras brutas.

• Comparação com métodos existentes de DNA nuclear: O DNA nuclear filogenético árvore obtida por Read2Tree foi comparada com a árvore gerada por RAD-Seq, outro método de DNA nuclear usado em estudos anteriores. Essa comparação avaliou a confiabilidade do Read2Tree.
• Integração com análise filogenética de cloroplastos: Árvores filogenéticas de genomas de cloroplastos foram construídas a partir dos mesmos dados brutos e comparadas com as árvores de DNA nucleares produzidas por Read2Tree. Essa abordagem investigou a discordância citonuclear, o descompasso entre cloroplastos e filogenias nucleares.
• Análise das causas de discordância: Utilizando dados de alinhamento genético individual por Read2Tree e combinando com outros métodos (D-estatística, DFOIL, QuIBL, etc.), analisamos se a discordância filogenética observada era causados por processos evolutivos complexos como Ordenação de linhagem incompleta (ILS), Introgressão, ou a antiga introgressão.

Resultados (Efetividade do Método)

Os resultados deste estudo revelaram os seguintes pontos, demonstrando a eficácia do método usando Read2Tree:

• Comparação de filogenias nucleares: As Read2Tree filogenias nucleares foram em grande parte concordantes com os relacionamentos relatados por um estudo anterior de RAD-Seq. Algumas colocações de táxons permaneceram incertas, então a análise não deve ser interpretada como resolvendo cada ramo de forma definitiva.
• Reutilização eficiente dos dados: O mesmo conjunto de dados de leitura curta suportava tanto a análise do genoma de cloroplastos quanto a inferência filogenética nuclear, tornando a abordagem mais econômica do que preparar conjuntos de dados separados de sequenciamento. Isso foi uma vantagem para aquisição de dados, não uma avaliação econômica formal.
• Análise da discordância filogenética: Múltiplas análises sugeriram que a ordenação incompleta de linhagem (ILS) explica a maior parte da discordância observada, enquanto a introgressão e a introgressão antiga também podem ter contribuído dentro de clados específicos.

Conclusão

O estudo mostrou que Read2Tree pode recuperar genes nucleares conservados a partir das mesmas leituras brutas usadas na análise do genoma dos cloroplastos. Isso permite comparar as filogenias nuclear e cloroplastidial e investigar as contribuições de incomplete lineage sorting (ILS) e introgressão. A posição de alguns táxons permaneceu incerta, e o estudo não resolveu definitivamente todos os ramos.

Esse método tem potencial para contribuir para reconstruções mais detalhadas e confiáveis das histórias evolutivas em futuras pesquisas filogenéticas de plantas.

Aplicações Potenciais para Pesquisa em Ingredientes Alimentares

Os pontos a seguir descrevem possíveis aplicações inferidas a partir do fluxo de trabalho filogenético validado. O artigo não testou diretamente o melhoramento de culturas, sabor, valor nutricional ou resistência a doenças.

Por exemplo, grupos como os Aurantioideae usados neste estudo incluem espécies de plantas importantes para usos alimentares e medicinais em todo o mundo. Compreender suas relações filogenéticas precisas e a complexa história evolutiva da hibridização é crucial para a melhoria das culturas na agricultura e para a conservação e utilização de valiosos recursos genéticos (como parentes selvagens) que podem se tornar futuras fontes de alimento.

Esse novo método, utilizando Read2Tree, permite a recuperação eficiente de informações tanto de DNA de cloroplastos quanto nucleares usando o mesmo conjunto de dados, possibilitando análises filogenéticas mais abrangentes e detalhadas de muitas espécies de culturas alimentares que antes eram difíceis de analisar.

Além disso, a capacidade de analisar processos genéticos complexos, como a triagem de linhagem incompleta (ILS) e a introgressão, fornece uma base para compreender, em nível genético, como características diversas das plantas alimentícias — como alto valor nutricional, sabores específicos e resistência a pragas e doenças — foram adquiridas e mantidas ao longo da história evolutiva.

Dessa forma, pode-se dizer que esse método oferece uma base importante para aprofundar nossa compreensão da diversidade de plantas usadas como alimento e para impulsionar pesquisas no desenvolvimento de variedades aprimoradas e utilização sustentável dos recursos.