Membaca DNA inti dan DNA kloroplas dari data sekuensing yang sama

Dengan Eranga Pawani Witharana sebagai penulis pertama, kelompok riset yang berpusat di laboratorium kami menunjukkan metode untuk memperoleh informasi filogenetik DNA inti secara efisien dari data sekuensing yang sama dengan yang digunakan dalam analisis genom kloroplas, sehingga kedua sumber data dapat dibandingkan secara terpadu.

Genom kloroplas (chloroplast; cp) banyak digunakan dalam filogenetika tumbuhan karena relatif kecil dan mudah dianalisis. Namun, pada banyak tumbuhan berbunga, cpDNA diwariskan dari satu induk—umumnya melalui garis maternal—sehingga dapat memberikan phylogenetic signal yang berbeda dari DNA inti yang diwariskan dari kedua induk. Karena itu, data kloroplas saja mungkin tidak cukup untuk menyelesaikan sebagian hubungan evolusi.

Untuk memperoleh informasi filogenetik yang lebih komprehensif, informasi DNA inti yang diwarisi dari kedua orang tuanya juga penting. DNA nuklir memberikan perspektif genetik yang lebih holistik daripada cpDNA. Namun, memperoleh informasi DNA nuklir lengkap sebelumnya dikaitkan dengan biaya tinggi. Dalam beberapa tahun terakhir, metode yang sangat hemat biaya untuk memperoleh data DNA inti telah muncul (misalnya, penangkapan target, pengurutan RNA), tetapi secara umum data kloroplas dan DNA inti perlu disiapkan secara terpisah.

Dalam studi ini, untuk mengatasi tantangan ini, kami fokus pada pengembangan dan validasi metode baru yang memperoleh informasi filogenetik DNA inti dari data urutan baca mentah (belum diproses) yang “sama persis” yang digunakan untuk analisis genom kloroplas.

Kami menggunakan alat komputasi baru yang disebut Read2Tree. Read2Tree memungkinkan ekstraksi langsung dan efisien rangkaian gen nuklir yang dilestarikan dari data rangkaian baca mentah.

Setelah makalah diterbitkan, kami membuka analysis pipeline di GitHub repository “Eranga-Witharana/rt2-phylogenomics” untuk memudahkan reproduksi dan penerapan workflow lebih lanjut.

Fitur utama dan keunggulan Read2Tree

• Hemat biaya: Menggunakan data mentah yang sama dengan analisis kloroplas mengurangi biaya perolehan data.
• Pengambilan data nuklir yang komprehensif: Pendekatan referensi yang dipandu genom memungkinkan ekstraksi sejumlah besar gen nuklir yang dilestarikan.
• Analisis yang disederhanakan: Berfungsi sebagai jalur terintegrasi mulai dari identifikasi gen hingga pembuatan penyelarasan hingga konstruksi pohon filogenetik.
• Tidak diperlukan persiapan khusus: Menggunakan kumpulan data referensi yang ada, sehingga menghilangkan kebutuhan untuk merancang dan memvalidasi kumpulan penyelidikan atau database spesifik spesies.
• Berguna untuk analisis ketidaksesuaian: Menghasilkan data penyelarasan gen individu, yang dapat digunakan untuk menyelidiki penyebab ketidaksesuaian filogenetik (seperti perbedaan antara pohon gen dan pohon spesies).

Validasi metode — contoh pada subfamili jeruk (Aurantioideae)

Untuk memvalidasi efektivitas dan kegunaan metode baru ini (analisis filogenetik DNA inti menggunakan Read2Tree), kami menargetkan kelompok tanaman Aurantioideae. Aurantioideae, yang mencakup jeruk dan kerabat dekatnya, merupakan kelompok penting dengan hubungan filogenetik yang kompleks.

Read2Tree digunakan untuk memperoleh sekuens gen inti terkonservasi dari 39 spesies Aurantioideae dan membandingkannya dengan filogeni genom kloroplas yang dibangun dari raw reads yang sama.

• Perbandingan dengan metode DNA inti yang ada — Pohon filogenetik DNA inti yang diperoleh dengan Read2Tree dibandingkan dengan pohon yang dibangun menggunakan RAD-Seq pada penelitian terdahulu untuk mengevaluasi keandalan Read2Tree.
• Integrasi dengan analisis filogenetik kloroplas — Pohon filogenetik genom kloroplas dibangun dari data mentah yang sama dan dibandingkan dengan pohon DNA inti dari Read2Tree untuk mengkaji ketidaksesuaian antara filogeni kloroplas dan inti (cytonuclear discordance).
• Analisis penyebab ketidaksesuaian — Data penyelarasan setiap gen dari Read2Tree digabungkan dengan D-statistic, DFOIL, QuIBL, dan metode lain untuk menganalisis peran pemilahan garis keturunan tidak lengkap (incomplete lineage sorting; ILS), introgresi gen (introgression), serta introgresi purba.

Hasil — efektivitas metode

Hasil penelitian ini mengungkapkan poin-poin berikut, yang menunjukkan efektivitas metode menggunakan Read2Tree:

• Perbandingan filogeni DNA inti—Filogeni Read2Tree secara umum selaras dengan hubungan yang dilaporkan dalam penelitian RAD-Seq sebelumnya. Posisi beberapa taxa masih tidak pasti, sehingga hasil ini tidak berarti setiap branch telah terselesaikan secara definitif.
• Penggunaan ulang data secara efisien—Short-read dataset yang sama dapat dipakai untuk analisis genom kloroplas dan inferensi filogeni DNA inti, sehingga lebih cost-efficient daripada menyiapkan dua sequencing datasets terpisah. Ini merupakan keuntungan dalam perolehan data, bukan evaluasi ekonomi formal.
• Analisis phylogenetic discordance—Berbagai analisis menunjukkan incomplete lineage sorting (ILS) sebagai penyebab utama sebagian besar ketidaksesuaian, sedangkan introgression dan ancient introgression mungkin turut berperan pada clades tertentu.

Kesimpulan

Penelitian ini menunjukkan bahwa Read2Tree dapat memperoleh conserved nuclear genes dari raw reads yang sama dengan chloroplast genome analysis, sehingga nuclear dan chloroplast phylogenies dapat dibandingkan dan kontribusi incomplete lineage sorting (ILS) serta introgression dapat diperiksa. Posisi beberapa taxa masih belum pasti; tidak semua branch diselesaikan secara definitif.

Metode ini berpotensi berkontribusi pada rekonstruksi sejarah evolusi yang lebih rinci dan andal dalam penelitian filogenetik tumbuhan di masa depan.

Potensi penerapan pada penelitian bahan pangan

Bagian berikut menjelaskan potensi penerapan yang disimpulkan dari phylogenetic workflow yang telah divalidasi. Makalah ini tidak secara langsung menguji pemuliaan tanaman, cita rasa, nilai gizi, atau ketahanan penyakit.

Misalnya, kelompok seperti Aurantioideae yang digunakan dalam penelitian ini mencakup spesies tumbuhan yang penting untuk keperluan pangan dan pengobatan di seluruh dunia. Memahami hubungan filogenetik yang tepat dan sejarah evolusi hibridisasi yang kompleks sangat penting untuk perbaikan tanaman di bidang pertanian dan untuk konservasi dan pemanfaatan sumber daya genetik yang berharga (seperti kerabat liar) yang mungkin menjadi sumber makanan di masa depan.

Metode baru yang menggunakan Read2Tree ini memungkinkan pengambilan informasi secara efisien dari kloroplas dan DNA inti menggunakan kumpulan data yang sama, sehingga memungkinkan analisis filogenetik yang lebih komprehensif dan terperinci terhadap banyak spesies tanaman pangan yang sebelumnya sulit dianalisis.

Selain itu, kemampuan untuk menganalisis proses genetik yang kompleks seperti penyortiran garis keturunan yang tidak lengkap (ILS) dan introgresi memberikan landasan untuk memahami, pada tingkat genetik, bagaimana beragam sifat tanaman pangan—seperti nilai gizi tinggi, rasa spesifik, dan ketahanan terhadap hama dan penyakit—telah diperoleh dan dipertahankan sepanjang sejarah evolusi.

Dengan demikian, metode ini dapat dikatakan memberikan landasan penting untuk memperdalam pemahaman kita tentang keanekaragaman tanaman yang digunakan sebagai makanan dan untuk mendorong penelitian menuju pengembangan varietas unggul dan pemanfaatan sumber daya berkelanjutan.