تحلیل DNA هسته‌ای و کلروپلاستی از همان sequencing reads

با خانم Eranga Pawani Witharana به عنوان نویسنده اول، یک گروه پژوهشی متمرکز در آزمایشگاه ما روشی را برای بازیابی مؤثر اطلاعات فیلوژنتیکی هسته ای از همان خوانش های توالی یابی مورد استفاده در تحلیل ژنوم کلروپلاست نشان داد که امکان مقایسه یکپارچه هر دو منبع داده را فراهم کرد.

ژنوم‌های کلروپلاست (cp) به‌دلیل اندازهٔ نسبتا کوچک و سهولت تحلیل، به‌طور گسترده در تبارزایی گیاهان استفاده می‌شوند. بااین‌حال، در بسیاری از نهاندانگان cpDNA تنها از یکی از والدین—اغلب از مادر—به ارث می‌رسد و ممکن است سیگنال تبارزایی متفاوتی از DNA هسته‌ایِ به‌ارث‌رسیده از هر دو والد داشته باشد. بنابراین داده‌های کلروپلاست به‌تنهایی ممکن است برای تعیین برخی روابط تکاملی کافی نباشد.

برای دستیابی به اطلاعات تبارزایی جامع‌تر، اطلاعات DNA هسته‌ای که از هر دو والد به ارث می‌رسد نیز مهم است و دیدگاه ژنتیکی گسترده‌تری از cpDNA ارائه می‌دهد. در گذشته به‌دست آوردن اطلاعات کامل DNA هسته‌ای پرهزینه بود. در سال‌های اخیر روش‌های کم‌هزینه‌تری مانند target capture وRNA sequencing پدید آمده‌اند، اما معمولا لازم بود داده‌های کلروپلاست و DNA هسته‌ای جداگانه آماده شوند.

برای حل این مسئله، این مطالعه بر توسعه و اعتبارسنجی روشی متمرکز شد که اطلاعات تبارزایی DNA هسته‌ای را از دقیقا همان raw sequencing reads—داده‌های پردازش‌نشده—مورد استفاده در تحلیل ژنوم کلروپلاست استخراج می‌کند.

ما از ابزار محاسباتی جدیدی به نام Read2Tree استفاده کردیم. Read2Tree توالی ژن‌های هسته‌ای حفاظت‌شده را مستقیما و به‌طور کارآمد از raw sequencing reads استخراج می‌کند.

پس از انتشار مقاله، برای تسهیل بازتولید و کاربرد بیشتر workflow، analysis pipeline را در GitHub repository «Eranga-Witharana/rt2-phylogenomics» به‌صورت عمومی منتشر کردیم.

ویژگی‌ها و مزایای اصلی Read2Tree

• کاهش هزینه: استفاده از همان raw data تحلیل کلروپلاست، هزینهٔ گردآوری دادهٔ تازه را کاهش می‌دهد.
• بازیابی گستردهٔ داده‌های هسته‌ای: رویکرد هدایت‌شده با reference genome امکان استخراج شمار زیادی ژن هسته‌ای حفاظت‌شده را فراهم می‌کند.
• تحلیل یکپارچه: یک pipeline از شناسایی ژن و ایجاد alignment تا ساخت درخت تبارزایی را اجرا می‌کند.
• بدون نیاز به آماده‌سازی اختصاصی: با استفاده از reference datasets موجود، نیازی به طراحی و اعتبارسنجی probe set یا database ویژهٔ هر گونه نیست.
• مناسب برای discordance analysis: alignment data هر ژن را تولید می‌کند و می‌توان از آن برای بررسی علل phylogenetic discordance، مانند اختلاف gene tree وspecies tree، استفاده کرد.

اعتبارسنجی روش: نمونهٔ گیاهان Aurantioideae

برای ارزیابی اثربخشی روش جدید تحلیل تبارزایی DNA هسته‌ای با Read2Tree، گروه گیاهی Aurantioideae انتخاب شد. این گروه که مرکبات و خویشاوندان نزدیک آن‌ها را دربر می‌گیرد، روابط تبارزایی پیچیده‌ای دارد.

مطالعه با Read2Tree توالی ژن‌های هسته‌ای حفاظت‌شده را برای 39 گونهٔ Aurantioideae بازیابی کرد و تبارزایی هسته‌ای حاصل را با درخت‌های ژنوم کلروپلاست ساخته‌شده از همان raw reads مقایسه کرد.

• مقایسه با روش‌های موجود DNA هسته‌ای: درخت تبارزایی DNA هسته‌ای حاصل از Read2Tree با درخت تولیدشده با RAD-Seq مقایسه شد. RAD-Seq روش دیگری برای DNA هسته‌ای است که در پژوهش‌های پیشین استفاده شده بود. این مقایسه قابلیت اعتماد Read2Tree را ارزیابی کرد.
• ادغام با تحلیل تبارزایی کلروپلاست: درخت‌های تبارزایی ژنوم کلروپلاست از همان raw data ساخته و با درخت‌های DNA هسته‌ای تولیدشده با Read2Tree مقایسه شدند. این کار cytonuclear discordance، یعنی اختلاف تبارزایی کلروپلاست و هسته، را بررسی کرد.
• تحلیل علل discordance: با ترکیب alignment data هر ژن از Read2Tree با روش‌هایی مانند D-statistic، DFOIL وQuIBL، بررسی کردیم که phylogenetic discordance مشاهده‌شده ناشی از incomplete lineage sorting (ILS)، introgression یا ancient introgression بوده است یا نه.

نتایج (اثربخشی روش)

نتایج، اثربخشی روش مبتنی بر Read2Tree را در موارد زیر نشان داد:

• مقایسهٔ تبارزایی هسته‌ای: نتایج Read2Tree تا حد زیادی با روابط گزارش‌شده در مطالعهٔ پیشین RAD-Seq سازگار بود. جایگاه برخی taxa نامشخص ماند؛ بنابراین نباید تحلیل را تعیین قطعی همهٔ شاخه‌ها دانست.
• استفادهٔ دوباره و کارآمد از داده‌ها: همان short-read dataset هم برای تحلیل ژنوم کلروپلاست و هم برای استنتاج تبارزایی هسته‌ای به‌کار رفت و از تهیهٔ sequencing datasets جداگانه کم‌هزینه‌تر بود. این مزیت مربوط به گردآوری داده است، نه یک ارزیابی رسمی اقتصادی.
• تحلیل phylogenetic discordance: چند تحلیل نشان داد incomplete lineage sorting (ILS) بیشتر اختلاف مشاهده‌شده را توضیح می‌دهد؛ همچنین درون‌آمیزی ژنی (introgression) وancient introgression ممکن است در برخی clades نقش داشته باشند.

نتیجه‌گیری

مطالعه نشان داد Read2Tree می‌تواند ژن‌های هسته‌ای حفاظت‌شده را از همان raw reads مورد استفاده در تحلیل ژنوم کلروپلاست بازیابی کند. این روش مقایسهٔ تبارزایی هسته‌ای و کلروپلاستی و بررسی سهم incomplete lineage sorting (ILS) وintrogression را ممکن می‌کند. جایگاه برخی taxa نامشخص ماند و مطالعه همهٔ شاخه‌ها را به‌طور قطعی تعیین نکرد.

این روش می‌تواند در پژوهش‌های آیندهٔ تبارزایی گیاهان به بازسازی دقیق‌تر و قابل‌اعتمادتر تاریخ تکاملی کمک کند.

کاربردهای احتمالی در پژوهش مواد غذایی

موارد زیر کاربردهایی هستند که از workflow تبارزایی اعتبارسنجی‌شده استنباط می‌شوند. مقاله به‌طور مستقیم اصلاح نباتات، طعم، ارزش تغذیه‌ای یا مقاومت به بیماری را آزمایش نکرد.

برای نمونه، گروه‌هایی مانند Aurantioideae شامل گیاهان مهم غذایی و دارویی در سراسر جهان‌اند. شناخت دقیق روابط تبارزایی و تاریخ پیچیدهٔ دورگ‌گیری آن‌ها برای بهبود محصولات کشاورزی و حفاظت و استفاده از منابع ژنتیکی ارزشمند—مانند خویشاوندان وحشی که ممکن است منابع غذایی آینده باشند—اهمیت دارد.

روش Read2Tree اطلاعات کلروپلاست و DNA هسته‌ای را به‌طور کارآمد از یک dataset بازیابی می‌کند و تحلیل تبارزایی جامع‌تر و دقیق‌تر بسیاری از محصولات غذایی را که پیش‌تر تحلیلشان دشوار بود، ممکن می‌سازد.

همچنین تحلیل فرآیندهای پیچیده‌ای مانند incomplete lineage sorting (ILS) وintrogression، پایه‌ای برای درک ژنتیکی چگونگی پیدایش و حفظ صفات گیاهان غذایی—از جمله ارزش تغذیه‌ای بالا، طعم‌های ویژه و مقاومت به آفات و بیماری‌ها—در طول تکامل فراهم می‌کند.

بدین‌ترتیب، این روش می‌تواند پایه‌ای مهم برای شناخت عمیق‌تر تنوع گیاهان مورد استفاده به‌عنوان غذا و پیشبرد پژوهش در زمینهٔ ارقام بهبودیافته و بهره‌برداری پایدار از منابع باشد.