Membaca DNA Nuklear dan Kloroplas daripada Bacaan Penjujukan yang Sama

Dengan Cik Eranga Pawani Witharana sebagai penulis pertama, satu kumpulan penyelidikan yang berpusat di makmal kami menunjukkan kaedah untuk memulihkan maklumat filogenetik nuklear dengan cekap daripada bacaan penjujukan yang sama yang digunakan untuk analisis genom kloroplas, membolehkan perbandingan bersepadu kedua-dua sumber data.

Genom kloroplas (cp) digunakan secara meluas dalam filogenetik tumbuhan kerana ia agak kecil dan mudah diuruskan. Namun, dalam banyak angiosperma, cpDNA diwarisi secara uniparental—sering kali secara ibu—dan oleh itu boleh membawa isyarat filogenetik yang berbeza daripada DNA nuklear yang diwarisi secara biparental. Data kloroplas sahaja mungkin tidak mencukupi untuk menyelesaikan beberapa hubungan evolusi.

Untuk mendapatkan maklumat filogenetik yang lebih menyeluruh, maklumat DNA nuklear, yang diwarisi daripada kedua-dua ibu bapa, juga penting. DNA nuklear memberikan perspektif genetik yang lebih holistik berbanding cpDNA. Walau bagaimanapun, memperoleh maklumat DNA nuklear penuh sebelum ini dikaitkan dengan kos yang tinggi. Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, kaedah yang sangat kos efektif untuk mendapatkan data DNA nuklear telah muncul (contohnya, penangkapan sasaran, RNA penjujukan), tetapi secara amnya adalah perlu untuk menyediakan data kloroplas dan data DNA nuklear secara berasingan.

Dalam kajian ini, untuk menangani cabaran ini, kami memberi tumpuan kepada pembangunan dan pengesahan kaedah baru yang memperoleh maklumat filogenetik nuklear DNA daripada data urutan bacaan mentah (tidak diproses) yang "sama" yang digunakan untuk analisis genom kloroplas.

Kami menggunakan alat pengiraan baru yang dipanggil Read2Tree. Read2Tree membolehkan pengekstrakan nuklear terpelihara secara langsung dan cekap jujukan gen daripada data urutan bacaan mentah.

Selepas artikel diterbitkan, kami menyediakan analysis pipeline secara terbuka dalam GitHub repository “Eranga-Witharana/rt2-phylogenomics” untuk memudahkan penghasilan semula dan penggunaan lanjut workflow tersebut.

Ciri-ciri utama dan kelebihan Read2Tree

• Kos efektif: Menggunakan data mentah yang sama seperti analisis kloroplas mengurangkan kos pemerolehan data.
• Pengambilan data nuklear yang komprehensif: Pendekatan berpandu genom rujukan membolehkan pengekstrakan sejumlah besar gen nuklear yang terpelihara.
• Analisis yang dipermudahkan: Berfungsi sebagai saluran bersepadu dari pengenalpastian gen melalui penjanaan penjajaran hingga pembinaan pokok filogenetik.
• Tiada persediaan khusus diperlukan: Menggunakan set data rujukan sedia ada, menghapuskan keperluan untuk mereka bentuk dan mengesahkan set probe atau pangkalan data khusus spesies.
• Berguna untuk analisis ketidakselarasan: Menghasilkan data penjajaran gen individu, yang boleh digunakan untuk menyiasat punca ketidakselarasan filogenetik (seperti perbezaan antara pokok gen dan pokok spesies).

Pengesahan Kaedah: Satu Contoh Menggunakan Tumbuhan Aurantioideae

Untuk mengesahkan keberkesanan dan kegunaan kaedah baru ini (analisis filogenetik nuklear DNA menggunakan Read2Tree), kami menyasarkan kumpulan tumbuhan Aurantioideae. Aurantioideae, yang merangkumi sitrus dan saudara rapatnya, adalah kumpulan penting dengan hubungan filogenetik yang kompleks.

Dengan menggunakan Read2Tree, kajian tersebut memulihkan urutan gen nuklear yang terpelihara untuk 39 spesies Aurantioideae dan membandingkan filogeni nuklear yang terhasil dengan pokok genom kloroplas yang dibina daripada bacaan mentah yang sama.

• Perbandingan dengan kaedah DNA nuklear sedia ada: DNA filogenetik nuklear pokok yang diperoleh oleh Read2Tree dibandingkan dengan pokok yang dijana oleh RAD-Seq, satu lagi kaedah DNA nuklear yang digunakan dalam kajian terdahulu. Perbandingan ini menilai kebolehpercayaan Read2Tree.
• Integrasi dengan analisis filogenetik kloroplas: Pokok filogenetik genom kloroplas dibina daripada data mentah yang sama dan dibandingkan dengan pokok DNA nuklear yang dihasilkan oleh Read2Tree. Pendekatan ini menyiasat ketidaksesuaian sitonuklear, iaitu ketidakpadanan antara kloroplas dan filogeni nuklear.
• Analisis punca ketidakselarasan: Menggunakan output data penjajaran gen individu dengan Read2Tree dan menggabungkannya dengan kaedah lain (D-statistik, DFOIL, QuIBL, dan sebagainya), kami menganalisis sama ada ketidakharmonian filogenetik yang diperhatikan adalah disebabkan oleh proses evolusi yang kompleks seperti Pengisihan garis keturunan tidak lengkap (ILS), introgresi, atau introgresi purba.

Keputusan (Keberkesanan Kaedah)

Keputusan kajian ini mendedahkan perkara-perkara berikut, menunjukkan keberkesanan kaedah menggunakan Read2Tree:

• Perbandingan filogeni nuklear: Filogeni nuklear Read2Tree sebahagian besarnya selaras dengan hubungan yang dilaporkan oleh kajian RAD-Seq terdahulu. Beberapa penempatan takson kekal tidak pasti, jadi analisis tidak harus dibaca sebagai menyelesaikan setiap cabang secara muktamad.
• Penggunaan semula data yang cekap: Set data bacaan pendek yang sama menyokong kedua-dua analisis genom kloroplas dan inferens filogenetik nuklear, menjadikan pendekatan ini lebih menjimatkan kos berbanding menyediakan set data penjujukan berasingan. Ini adalah kelebihan pemerolehan data, bukan penilaian ekonomi formal.
• Analisis ketidaksesuaian filogenetik: Pelbagai analisis mencadangkan bahawa pengasingan garis keturunan yang tidak lengkap (ILS) menerangkan kebanyakan ketidaksesuaian yang diperhatikan, manakala introgresi dan introgresi kuno juga mungkin menyumbang dalam klad tertentu.

Kesimpulan

Kajian ini menunjukkan bahawa Read2Tree boleh memulihkan gen nuklear yang terpelihara daripada bacaan mentah yang sama digunakan untuk analisis genom kloroplas, membolehkan perbandingan filogeni nuklear dan kloroplas serta penyelidikan sumbangan daripada pengisihan garis keturunan yang tidak lengkap (ILS) dan introgresi. Beberapa penempatan takson kekal tidak pasti, dan kajian ini tidak menyelesaikan setiap cabang secara muktamad.

Kaedah ini berpotensi menyumbang kepada pembinaan semula sejarah evolusi yang lebih terperinci dan boleh dipercayai dalam penyelidikan filogenetik tumbuhan pada masa hadapan.

Aplikasi Berpotensi untuk Penyelidikan Bahan Makanan

Perkara berikut menerangkan aplikasi berpotensi yang disimpulkan daripada aliran kerja filogenetik yang telah disahkan. Kertas kerja itu tidak menguji secara langsung pembiakan tanaman, rasa, nilai pemakanan, atau ketahanan penyakit.

Sebagai contoh, kumpulan seperti Aurantioideae yang digunakan dalam kajian ini termasuk spesies tumbuhan yang penting untuk kegunaan makanan dan perubatan di seluruh dunia. Memahami hubungan filogenetik mereka yang tepat dan sejarah evolusi hibridisasi yang kompleks adalah penting untuk penambahbaikan tanaman dalam pertanian serta untuk pemuliharaan dan penggunaan sumber genetik berharga (seperti saudara liar) yang mungkin menjadi sumber makanan masa depan.

Kaedah baru ini menggunakan Read2Tree membolehkan pengambilan maklumat yang cekap daripada kedua-dua kloroplas dan DNA nuklear menggunakan set data yang sama, membolehkan analisis filogenetik yang lebih menyeluruh dan terperinci bagi banyak spesies tanaman makanan yang sebelum ini sukar dianalisis.

Selain itu, keupayaan untuk menganalisis proses genetik yang kompleks seperti pengasingan garis keturunan yang tidak lengkap (ILS) dan introgresi menyediakan asas untuk memahami, di peringkat genetik, bagaimana ciri-ciri pelbagai tumbuhan makanan—seperti nilai pemakanan yang tinggi, perisa khusus, dan ketahanan terhadap perosak serta penyakit—telah diperoleh dan dikekalkan sepanjang sejarah evolusi.

Dengan cara ini, kaedah ini boleh dikatakan menawarkan asas penting untuk memperdalam pemahaman kita tentang kepelbagaian tumbuhan yang digunakan sebagai makanan dan untuk mendorong penyelidikan ke arah pembangunan varieti yang lebih baik dan penggunaan sumber yang lestari.