Analyse von Kern- und Chloroplasten-DNA aus denselben Sequenzierungsreads

Unter der Erstautorenschaft von Frau Eranga Pawani Witharana demonstrierte eine an unserem Labor angesiedelte Forschungsgruppe eine Methode zur effizienten Gewinnung phylogenetischer Informationen aus dem Zellkern – und zwar aus denselben Sequenzier-Reads, die auch für die Analyse des Chloroplastengenoms verwendet wurden. Dies ermöglicht einen integrierten Vergleich beider Datenquellen.

Chloroplastengenome (cp-Genome) werden in der Pflanzenphylogenetik häufig verwendet, da sie relativ klein und gut handhabbar sind. Bei vielen Angiospermen wird cpDNA jedoch uniparental – oft mütterlich – vererbt und kann daher ein anderes phylogenetisches Signal tragen als das biparental vererbte nukleäre DNA. Chloroplastendaten allein reichen daher möglicherweise nicht aus, um einige evolutionäre Verwandtschaftsverhältnisse aufzuklären.

Um umfassendere phylogenetische Informationen zu erhalten, sind auch nukleäre DNA-Informationen, die von beiden Eltern vererbt werden, wichtig. Nukleäre DNA-Informationen bieten eine ganzheitlichere genetische Perspektive als cpDNA. Die Gewinnung vollständiger nukleärer DNA-Informationen war jedoch bisher mit hohen Kosten verbunden. In den letzten Jahren haben sich kostengünstige Methoden zur Gewinnung nukleärer DNA-Daten entwickelt (z. B. Target Capture, RNA-Sequenzierung), aber es war bisher in der Regel notwendig, Chloroplasten- und nukleäre DNA-Daten separat aufzubereiten.

In dieser Studie konzentrierten wir uns zur Bewältigung dieser Herausforderung auf die Entwicklung und Validierung einer neuen Methode, die phylogenetische Informationen aus der Kern-DNA aus exakt denselben rohen (unverarbeiteten) Sequenz-Reads gewinnt, die für die Analyse des Chloroplastengenoms verwendet wurden.

Wir verwendeten ein neues Computerprogramm namens Read2Tree. Read2Tree ermöglicht die direkte und effiziente Extraktion konservierter Gensequenzen aus dem Zellkern (nukleärer Gensequenzen) aus rohen Read-Sequenzdaten.

Nach der Veröffentlichung der Arbeit stellten wir die Analyse-Pipeline auf GitHub unter „Eranga-Witharana/rt2-phylogenomics“ zur Verfügung, um die Reproduktion und weitere Anwendung des Arbeitsablaufs zu erleichtern.

Hauptmerkmale und Vorteile von Read2Tree

• Kosteneffizient: Die Verwendung derselben Rohdaten wie bei der Chloroplastenanalyse senkt die Kosten für die Datengewinnung.
• Umfassende Gewinnung von Kerngen-Daten: Ein auf Referenzgenomen basierender Ansatz ermöglicht die Extraktion einer großen Anzahl konservierter Kerngene.
• Effiziente Analyse: Fungiert als integrierte Pipeline – von der Genidentifizierung über die Erstellung von Alignments bis hin zur Konstruktion phylogenetischer Bäume.
• Keine spezifische Vorbereitung erforderlich: Nutzt vorhandene Referenzdatensätze, wodurch das Design und die Validierung artenspezifischer Sondensets oder Datenbanken entfallen.
• Nützlich für die Analyse von Diskordanzen: Liefert Alignment-Daten für einzelne Gene, die zur Untersuchung der Ursachen phylogenetischer Diskordanzen (wie Diskrepanzen zwischen Gen- und Artenbäumen) verwendet werden können.

Methodenvalidierung: Ein Beispiel anhand von Pflanzen der Unterfamilie Aurantioideae

Um die Wirksamkeit und den Nutzen dieser neuen Methode (nukleare DNA-Phylogenieanalyse unter Verwendung von Read2Tree) zu validieren, konzentrierten wir uns auf die Pflanzengruppe der Aurantioideae. Die Aurantioideae, zu denen Zitruspflanzen und deren nahe Verwandte gehören, stellen eine wichtige Gruppe mit komplexen phylogenetischen Beziehungen dar.

Unter Verwendung von Read2Tree wurden konservierte nukleäre Gensequenzen für 39 Aurantioideae-Arten gewonnen; die daraus resultierenden nukleären Phylogenien wurden anschließend mit Stammbäumen des Chloroplastengenoms verglichen, die aus denselben Rohdaten (Raw Reads) erstellt worden waren.

• Vergleich mit bestehenden Methoden für Kern-DNA: Der mit Read2Tree gewonnene phylogenetische Baum der Kern-DNA wurde mit dem mittels RAD-Seq erstellten Baum verglichen, der auf einer anderen, in früheren Studien verwendeten Methode für Kern-DNA beruht. Dieser Vergleich diente der Bewertung der Zuverlässigkeit von Read2Tree.
• Integration mit phylogenetischen Chloroplasten-Analysen: Phylogenetische Bäume von Chloroplastengenomen wurden aus denselben Rohdaten erstellt und mit den nukleären DNA-Bäumen verglichen, die mittels Read2Tree generiert wurden. Dieser Ansatz untersuchte die cyto-nukleäre Diskordanz, also die Diskrepanz zwischen Chloroplasten- und Kern-Phylogenien.
• Analyse der Ursachen für Diskordanzen: Unter Verwendung der von Read2Tree ausgegebenen Alignierungsdaten einzelner Gene und deren Kombination mit anderen Methoden (D-Statistik, DFOIL, QuIBL usw.) analysierten wir, ob die beobachtete phylogenetische Diskordanz durch komplexe evolutionäre Prozesse wie unvollständige Liniensortierung (ILS), Introgression oder durch alte Introgression verursacht wurde.

Ergebnisse (Wirksamkeit der Methode)

Die Ergebnisse dieser Studie zeigten Folgendes auf und belegten die Wirksamkeit der Methode unter Verwendung von Read2Tree:

• Vergleich der Kern-Phylogenien: Die auf Read2Tree basierenden Kern-Phylogenien stimmten weitgehend mit den Verwandtschaftsverhältnissen überein, über die in einer früheren Studie (RAD-Seq) berichtet wurde. Die Zuordnung einiger Taxa blieb unsicher; daher sollte die Analyse nicht so verstanden werden, als würde sie jeden Verzweigungspunkt endgültig klären.
• Effiziente Datennutzung: Derselbe Short-Read-Datensatz diente sowohl der Analyse des Chloroplastengenoms als auch der phylogenetischen Rekonstruktion auf Basis von Kerngenen; dadurch war dieser Ansatz kosteneffizienter als die Erstellung separater Sequenzierungsdatensätze. Es handelte sich hierbei um einen Vorteil bei der Datengewinnung, nicht um eine formale wirtschaftliche Bewertung.
• Analyse phylogenetischer Diskrepanzen: Mehrere Analysen deuteten darauf hin, dass unvollständige Liniensortierung (ILS) den Großteil der beobachteten Diskrepanzen erklärt, während in bestimmten Kladen auch Introgression sowie frühe Introgression (Ancient Introgression) eine Rolle gespielt haben könnten.

Schlussfolgerung

Die Studie zeigte, dass sich mittels Read2Tree konservierte Kerngene aus denselben Rohdaten (Raw Reads) gewinnen lassen, die auch für die Analyse des Chloroplastengenoms verwendet wurden. Dies ermöglichte den Vergleich von Kern- und Chloroplasten-Phylogenien sowie die Untersuchung der Beiträge von unvollständiger Lineage-Sortierung (ILS) und Introgression. Die systematische Einordnung einiger Taxa blieb unsicher, und nicht alle Verzweigungen konnten im Rahmen der Studie eindeutig geklärt werden.

Diese Methode hat das Potenzial, zu detaillierteren und zuverlässigeren Rekonstruktionen der Evolutionsgeschichte in der künftigen phylogenetischen Forschung an Pflanzen beizutragen.

Mögliche Anwendungen in der Forschung zu Lebensmittelinhaltsstoffen

Die folgenden Punkte beschreiben potenzielle Anwendungen, die sich aus dem validierten phylogenetischen Arbeitsablauf ableiten lassen. Die Studie untersuchte nicht direkt Aspekte wie Pflanzenzüchtung, Geschmack, Nährwert oder Krankheitsresistenz.

So umfassen beispielsweise Gruppen wie die Aurantioideae, die in dieser Studie untersucht wurden, Pflanzenarten, die weltweit für die Ernährung und medizinische Zwecke von Bedeutung sind. Das Verständnis ihrer genauen phylogenetischen Beziehungen und der komplexen Evolutionsgeschichte der Hybridisierung ist entscheidend für die Pflanzenzüchtung in der Landwirtschaft sowie für die Erhaltung und Nutzung wertvoller genetischer Ressourcen (wie etwa wildlebender Verwandter), die künftig als Nahrungsquellen dienen könnten.

Diese neue Methode unter Verwendung von Read2Tree ermöglicht die effiziente Gewinnung von Informationen sowohl aus Chloroplasten- als auch aus Zellkern-DNA auf der Basis desselben Datensatzes. Dies erlaubt umfassendere und detailliertere phylogenetische Analysen zahlreicher Nutzpflanzenarten, die zuvor nur schwer zu untersuchen waren.

Darüber hinaus schafft die Möglichkeit, komplexe genetische Prozesse wie unvollständige Liniensortierung (ILS) und Introgression zu analysieren, eine Grundlage für das Verständnis auf genetischer Ebene: Es lässt sich nachvollziehen, wie vielfältige Eigenschaften von Nutzpflanzen – etwa ein hoher Nährwert, spezifische Geschmacksprofile sowie Resistenzen gegen Schädlinge und Krankheiten – im Laufe der Evolutionsgeschichte erworben und bewahrt wurden.

Somit bietet diese Methode eine wichtige Basis, um das Verständnis für die Vielfalt der als Nahrungsmittel genutzten Pflanzen zu vertiefen und die Forschung zur Entwicklung verbesserter Sorten sowie zur nachhaltigen Ressourcennutzung voranzutreiben.