تحليل DNA النووي وDNA البلاستيدة الخضراء من sequencing reads نفسها

وبصفتها السيدة Eranga Pawani Witharana المؤلفة الأولى، أظهرت مجموعة بحثية مركزة في مختبرنا طريقة لاستعادة المعلومات التطورية النووية بكفاءة من نفس قراءات التسلسل المستخدمة لتحليل جينوم البلاستيدات الخضراء، مما أتاح المقارنة المتكاملة بين مصدري البيانات.

تُستخدم جينومات البلاستيدات الخضراء (cp) على نطاق واسع في علم تطور سلالات النباتات لأنها صغيرة نسبيا ويسهل تحليلها. غير أن cpDNA تُورث في كثير من كاسيات البذور من أحد الوالدين فقط—وغالبا من الأم—ولذلك قد تحمل إشارة تطورية تختلف عن إشارة DNA النووي الموروث من كلا الوالدين. ومن ثم قد لا تكفي بيانات البلاستيدات الخضراء وحدها لحسم بعض العلاقات التطورية.

للحصول على معلومات تطورية أشمل، تعد معلومات DNA النووي الموروث من كلا الوالدين مهمة أيضا؛ فهي توفر منظورا وراثيا أوسع من cpDNA. وكان الحصول على معلومات كاملة عن DNA النووي مرتفع التكلفة في السابق. وقد ظهرت في السنوات الأخيرة طرق أقل كلفة، مثل target capture وRNA sequencing، لكن كان يلزم عادة إعداد بيانات البلاستيدة الخضراء والبيانات النووية كل على حدة.

لمعالجة هذه المشكلة، ركزت الدراسة على تطوير طريقة جديدة والتحقق منها، تستخرج معلومات تطورية من DNA النووي انطلاقا من raw sequencing reads نفسها تماما—أي البيانات غير المعالجة—المستخدمة في تحليل جينوم البلاستيدة الخضراء.

استخدمنا أداة حاسوبية جديدة تسمى Read2Tree. وتتيح Read2Tree الاستخراج المباشر والفعال لتسلسلات الجينات النووية المحفوظة من raw sequencing reads.

بعد نشر المقالة، أتحنا analysis pipeline في GitHub repository «Eranga-Witharana/rt2-phylogenomics» لتسهيل إعادة إنتاج workflow وتطبيقه لاحقا.

الخصائص والمزايا الرئيسية لـ Read2Tree

• خفض الكلفة: يؤدي استخدام raw data نفسها المستخدمة في تحليل البلاستيدة الخضراء إلى تقليل كلفة الحصول على البيانات.
• استرجاع واسع للبيانات النووية: يتيح النهج الموجّه بواسطة reference genome استخراج عدد كبير من الجينات النووية المحفوظة.
• تحليل مبسّط ومتكامل: يعمل كـpipeline يبدأ بتحديد الجينات، ثم إنشاء alignment، وينتهي ببناء شجرة تطورية.
• لا حاجة إلى إعداد مخصص: يستخدم reference datasets موجودة، ولذلك لا يلزم تصميم probe sets أو databases خاصة بكل نوع والتحقق منها.
• مفيد لتحليل discordance: ينتج alignment data لكل جين، ويمكن استخدامها لدراسة أسباب phylogenetic discordance، مثل الاختلاف بين gene trees وspecies trees.

التحقق من الطريقة: مثال باستخدام نباتات Aurantioideae

للتحقق من فعالية الطريقة الجديدة وفائدتها—أي التحليل التطوري لـDNA النووي باستخدام Read2Tree—ركزنا على مجموعة Aurantioideae النباتية. وتضم هذه المجموعة الحمضيات وأقاربها المقربين، ولها علاقات تطورية معقدة.

استعادت الدراسة باستخدام Read2Tree تسلسلات جينات نووية محفوظة لـ39 نوعا من Aurantioideae، ثم قارنت العلاقات التطورية النووية الناتجة بأشجار جينوم البلاستيدة الخضراء المبنية من raw reads نفسها.

• المقارنة بطرق DNA النووي الموجودة: قورنت شجرة DNA النووي التطورية المستخرجة بـRead2Tree مع الشجرة الناتجة من RAD-Seq. ويعد RAD-Seq طريقة أخرى لتحليل DNA النووي استُخدمت في دراسات سابقة. وأتاحت هذه المقارنة تقييم موثوقية Read2Tree.
• التكامل مع تحليل تطور البلاستيدة الخضراء: بُنيت أشجار تطورية لجينومات البلاستيدات الخضراء من raw data نفسها وقورنت بأشجار DNA النووي الناتجة من Read2Tree. وبذلك دُرس cytonuclear discordance، أي عدم التطابق بين العلاقات التطورية للبلاستيدة الخضراء والنواة.
• تحليل أسباب discordance: باستخدام alignment data لكل جين الناتجة من Read2Tree، ودمجها بطرائق أخرى مثل D-statistic وDFOIL وQuIBL، حللنا ما إذا كان phylogenetic discordance المرصود ناتجا من عمليات تطورية معقدة مثل incomplete lineage sorting (ILS) أو introgression أو ancient introgression.

النتائج (فعالية الطريقة)

أظهرت نتائج الدراسة النقاط الآتية، وهي توضح فعالية الطريقة القائمة على Read2Tree:

• مقارنة العلاقات التطورية النووية: اتفقت النتائج النووية المستخرجة بـRead2Tree إلى حد كبير مع العلاقات التي أبلغت عنها دراسة سابقة باستخدام RAD-Seq. وبقي موضع بعض taxa غير محسوم، ولذلك لا ينبغي تفسير التحليل على أنه حسم كل فرع نهائيا.
• إعادة استخدام البيانات بكفاءة: أتاحت short-read dataset نفسها تحليل جينوم البلاستيدة الخضراء والاستدلال التطوري النووي معا، مما يجعل النهج أقل كلفة من إعداد sequencing datasets منفصلة. وهذه ميزة في الحصول على البيانات وليست تقييما اقتصاديا رسميا.
• تحليل phylogenetic discordance: أشارت تحليلات متعددة إلى أن incomplete lineage sorting (ILS) يفسر معظم الاختلاف المرصود، مع احتمال إسهام introgression وancient introgression أيضا في بعض clades.

الخلاصة

أظهرت الدراسة أن Read2Tree يستطيع استرجاع الجينات النووية المحفوظة من raw reads نفسها المستخدمة في تحليل جينوم البلاستيدة الخضراء، مما يتيح مقارنة العلاقات التطورية النووية والبلاستيدية ودراسة إسهام incomplete lineage sorting (ILS) وintrogression. وبقي موضع بعض taxa غير محسوم، ولم تحسم الدراسة كل الفروع نهائيا.

يمكن لهذه الطريقة أن تسهم مستقبلا في إعادة بناء التاريخ التطوري للنباتات بمزيد من التفصيل والموثوقية.

إمكانات التطبيق في بحوث المواد الغذائية

تصف النقاط الآتية تطبيقات محتملة استُنتجت من workflow التطوري الذي جرى التحقق منه. ولم تختبر المقالة مباشرة تربية المحاصيل أو النكهة أو القيمة الغذائية أو مقاومة الأمراض.

فعلى سبيل المثال، تضم مجموعات مثل Aurantioideae المستخدمة في هذه الدراسة أنواعا نباتية مهمة للأغذية والدواء حول العالم. ويعد فهم علاقاتها التطورية الدقيقة وتاريخها المعقد من التهجين ضروريا لتحسين المحاصيل، ولحفظ الموارد الوراثية القيّمة—مثل الأقارب البرية التي قد تصبح مصادر غذائية مستقبلا—واستخدامها.

تتيح الطريقة الجديدة القائمة على Read2Tree استرجاع معلومات البلاستيدة الخضراء وDNA النووي بكفاءة من dataset واحدة، وبذلك تسمح بإجراء تحليلات تطورية أشمل وأكثر تفصيلا لعدد كبير من المحاصيل الغذائية التي كان تحليلها صعبا من قبل.

كما أن القدرة على تحليل عمليات وراثية معقدة مثل incomplete lineage sorting (ILS) وintrogression توفر أساسا لفهم كيفية اكتساب صفات متنوعة في النباتات الغذائية—مثل القيمة الغذائية العالية والنكهات المميزة ومقاومة الآفات والأمراض—وكيفية الحفاظ عليها عبر التاريخ التطوري.

وبذلك توفر هذه الطريقة أساسا مهما لتعميق فهم تنوع النباتات المستخدمة غذاء، ولدفع البحوث نحو تطوير أصناف محسّنة والاستخدام المستدام للموارد.