Analisi del DNA nucleare e cloroplastico dalle stesse letture di sequenziamento

Con la signora Eranga Pawani Witharana come prima autrice, un gruppo di ricerca centrato nel nostro laboratorio ha dimostrato un metodo per recuperare in modo efficiente le informazioni filogenetiche nucleari dalle stesse letture di sequenziamento utilizzate per l'analisi del genoma dei cloroplasti, consentendo un confronto integrato di entrambe le fonti di dati.

I genomi dei cloroplasti (cp) sono ampiamente utilizzati nella filogenetica vegetale perché sono relativamente piccoli e trattabili. In molte angiosperme, tuttavia, cpDNA è ereditato in modo uniparentale, spesso per via materna, e può quindi trasportare un segnale filogenetico diverso dal nucleare DNA ereditato in modo biparentale. Di conseguenza, i soli dati sui cloroplasti potrebbero essere insufficienti per risolvere alcune relazioni evolutive.

Per ottenere informazioni filogenetiche più complete, sono importanti anche le informazioni nucleari DNA, ereditate da entrambi i genitori. Nuclear DNA offre una prospettiva genetica più olistica rispetto a cpDNA. Tuttavia, l’acquisizione di informazioni complete sul nucleare DNA era precedentemente associata a costi elevati. Negli ultimi anni sono emersi metodi altamente convenienti per ottenere dati nucleari DNA (ad esempio, cattura del bersaglio, sequenziamento RNA), ma in genere è stato necessario preparare separatamente i dati sui cloroplasti e sui nucleari DNA.

In questo studio, per affrontare questa sfida, ci siamo concentrati sullo sviluppo e sulla validazione di un nuovo metodo che ottiene informazioni filogenetiche nucleari DNA dagli "esattamente gli stessi" dati grezzi (non elaborati) della sequenza di lettura utilizzati per l'analisi del genoma dei cloroplasti.

Abbiamo utilizzato un nuovo strumento computazionale chiamato Read2Tree. Read2Tree consente l'estrazione diretta ed efficiente di sequenze di geni nucleari conservate da dati grezzi di sequenze lette.

Dopo la pubblicazione del documento, abbiamo rilasciato la pipeline di analisi su GitHub su "Eranga-Witharana/rt2-filogenomica" per facilitare la riproduzione e l'ulteriore applicazione del flusso di lavoro.

Principali caratteristiche e vantaggi di Read2Tree

• Conveniente: l'utilizzo degli stessi dati grezzi dell'analisi dei cloroplasti riduce i costi di acquisizione dei dati.
• Recupero completo dei dati nucleari: un approccio guidato dal genoma di riferimento consente l'estrazione di un gran numero di geni nucleari conservati.
• Analisi semplificata: funziona come una pipeline integrata dall'identificazione dei geni attraverso la generazione dell'allineamento fino alla costruzione dell'albero filogenetico.
• Non è richiesta alcuna preparazione personalizzata: utilizza i set di dati di riferimento esistenti, eliminando la necessità di progettare e convalidare set di sonde o database specifici per specie.
• Utile per l'analisi della discordanza: genera dati di allineamento genetico individuale, che possono essere utilizzati per indagare sulle cause della discordanza filogenetica (come discrepanze tra alberi genetici e alberi specie).

Convalida del metodo: un esempio utilizzando piante Aurantioideae

Per convalidare l'efficacia e l'utilità di questo nuovo metodo (analisi filogenetica nucleare DNA utilizzando Read2Tree), abbiamo preso di mira il gruppo vegetale Aurantioideae. Aurantioideae, che comprende gli agrumi e i suoi parenti stretti, è un gruppo importante con complesse relazioni filogenetiche.

Utilizzando Read2Tree, lo studio ha recuperato sequenze genetiche nucleari conservate per 39 specie di Aurantioideae e ha confrontato le filogenesi nucleari risultanti con alberi di genomi dei cloroplasti costruiti dalle stesse letture grezze.

• Confronto con i metodi nucleari DNA esistenti: l'albero filogenetico nucleare DNA ottenuto da Read2Tree è stato confrontato con l'albero generato da RAD-Seq, un altro metodo nucleare DNA utilizzato in studi precedenti. Questo confronto ha valutato l'affidabilità di Read2Tree.
• Integrazione con l'analisi filogenetica dei cloroplasti: alberi filogenetici dei genomi dei cloroplasti sono stati costruiti dagli stessi dati grezzi e confrontati con gli alberi nucleari DNA prodotti da Read2Tree. Questo approccio ha studiato la discordanza citonucleare, la mancata corrispondenza tra cloroplasti e filogenesi nucleari.
• Analisi delle cause di discordanza: utilizzando i dati di allineamento genetico individuale forniti da Read2Tree e combinandoli con altri metodi (statistica D, DFOIL, QuIBL, ecc.), abbiamo analizzato se la discordanza filogenetica osservata era causata da processi evolutivi complessi come ordinamento per discendenza incompleta (ILS), introgressione o antichi introgressione.

Risultati (efficacia del metodo)

I risultati di questo studio hanno evidenziato i seguenti punti, dimostrando l'efficacia del metodo utilizzando Read2Tree:

• Confronto delle filogenesi nucleari: le filogenesi nucleari Read2Tree erano in gran parte concordanti con le relazioni riportate da un precedente studio RAD-Seq. Alcuni collocamenti taxon sono rimasti incerti, quindi l'analisi non deve essere letta come se risolvesse ogni ramo in modo definitivo.
• Riutilizzo efficiente dei dati: lo stesso set di dati a lettura breve ha supportato sia l'analisi del genoma dei cloroplasti che l'inferenza filogenetica nucleare, rendendo l'approccio più conveniente rispetto alla preparazione di set di dati di sequenziamento separati. Si è trattato di un vantaggio nell’acquisizione dei dati, non di una valutazione economica formale.
• Analisi della discordanza filogenetica: analisi multiple hanno suggerito che l'ordinamento incompleto del lignaggio (ILS) spiega la maggior parte della discordanza osservata, mentre l'introgressione e l'introgressione antica potrebbero aver contribuito anche all'interno di particolari cladi.

Conclusione

Lo studio ha dimostrato che Read2Tree può recuperare geni nucleari conservati dalle stesse letture grezze utilizzate per l'analisi del genoma dei cloroplasti, consentendo il confronto delle filogenesi nucleari e dei cloroplasti e l'analisi dei contributi derivanti dallo smistamento di lignaggio incompleto (ILS) e dall'introgressione. Alcuni posizionamenti dei taxon sono rimasti incerti e lo studio non ha risolto definitivamente ogni ramo.

Questo metodo ha il potenziale per contribuire a ricostruzioni più dettagliate e affidabili delle storie evolutive nella futura ricerca filogenetica sulle piante.

Potenziali applicazioni alla ricerca sugli ingredienti alimentari

I seguenti punti descrivono le potenziali applicazioni dedotte dal flusso di lavoro filogenetico convalidato. Lo studio non ha testato direttamente la selezione delle colture, il sapore, il valore nutrizionale o la resistenza alle malattie.

Ad esempio, gruppi come le Aurantioideae utilizzate in questo studio includono specie vegetali importanti per usi alimentari e medicinali in tutto il mondo. Comprendere le loro precise relazioni filogenetiche e la complessa storia evolutiva dell'ibridazione è cruciale per il miglioramento delle colture in agricoltura e per la conservazione e l'utilizzo di preziose risorse genetiche (come i parenti selvatici) che potrebbero diventare future fonti di cibo.

Questo nuovo metodo che utilizza Read2Tree consente il recupero efficiente di informazioni sia dal cloroplasto che dal nucleare DNA utilizzando lo stesso set di dati, consentendo analisi filogenetiche più complete e dettagliate di molte specie di colture alimentari che in precedenza erano difficili da analizzare.

Inoltre, la capacità di analizzare processi genetici complessi come lo smistamento di lignaggio incompleto (ILS) e l'introgressione fornisce una base per comprendere, a livello genetico, come i diversi tratti delle piante alimentari, come l'alto valore nutrizionale, i sapori specifici e la resistenza a parassiti e malattie, siano stati acquisiti e mantenuti nel corso della storia evolutiva.

In questo modo, si può dire che questo metodo offra una base importante per approfondire la nostra comprensione della diversità delle piante utilizzate come cibo e per guidare la ricerca verso lo sviluppo di varietà migliorate e l'utilizzo sostenibile delle risorse.